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Ein Ansatz enthielt Protein und Toxin im Verhältnis von

∆DNT : GTPase  1 : 2

CNF1

full length

: GTPase  1 : 10

tTG (1µg/µl)  3 µl in 30 µl Ansatz

Ein Ansatz von 30 µl enthielt außerdem:

3 µl 10x-Transglutaminase-Puffer

5 µl gesättigte Monodansylcadaverin-Lösung

50 mM Tris/HCl pH 8,0 ad 30 µl.

In vivo laufen Transglutaminierungsreaktionen in leicht basischem Milieu ab. Daher wurde

für die Versuche mit Transglutaminasen Tris/HCl mit einem pH-Wert von 8,0 als Puffer

verwendet. Die gesättigte Monodansylcadaverin-Lösung wurde hergestellt, indem eine

Spatelspitze Monodansylcadaverin in 400 µl Tris/HCl pH 8,0 resuspendiert und gut gevortext

wurde. Nach dem Absinken des ausfallenden Monodansylcadaverins wurde der maximal mit

Monodansylcadaverin gesättigte Überstand a/jointfilesconvert/377385/bgenommen und für den Versuch verwendet. Die

Aktivität der Gewebstransglutaminase betrug 0,025 U/10 µl.

Um unspezifische Bindung des Monodansylcadaverins an die GTPase auszuschließen, wurde

je ein Ansatz mit und einer ohne Zusatz von Toxin inkubiert. Auf jedem Gel lief eine Probe

mit RhoA als Referenzwert mit.

Die Ansätze wurden nach Zugabe des Toxins 30 Minuten lang bei 29°C (DNT) bzw. 37°C

(CNF1 und tTG) inkubiert, die Reaktion mit Probenpuffer gestoppt und die Proben gekocht

und auf das Gel aufgetragen.

Das Gel wurde vor dem Färben unter einem UV-Leuchtschirm ausgewertet. Für die

qualitative Auswertung wurde das Fluoreszenzbild ausgedruckt. Die quantitative Auswertung

der Daten erfolgte mit Hilfe eines Computerprogramm (ImageQuant 5.2, Molecular

Dynamics). Dabei wurde die Fluoreszenz durch Densitometrie der Banden quantifiziert. Die

Fluoreszenz von RhoA diente als Referenzwert von 100%. Mittelwert und

Standardabweichung von je drei Versuchen pro GTPase wurden berechnet und graphisch

dargestellt.

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