E3Switch DE3 Manual do Utilizador descarregar pdf (Página 51)

trägt, nicht methyliert ist. Dpn1 schneidet spezifisch methylierte DNA an der Zielsequenz

5’Gm6AC-3’.

1 µl Dpn1 (10 U/µl) wurde pro Ansatz zugegeben und 1-2 Stunden bei 37°C auf dem

Schüttler inkubiert.

3.7 Agarosegelelektrophorese

Mittels Agarosegelelektrophorese können DNA-Fragmente, PCR-Produkte und Plasmid-DNA

nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Sie wandern durch ein Netz, das durch das pflanzliche

Poylsaccharid Agarose im Gel gebildet wird. Der Farbstoff Ethidiumbromid, der in das Gel

gegeben wird, interkaliert in die DNA und fluoresziert unter UV-Licht.

Die Agarosegelelektrophorese diente der Kontrolle der in der Mutagenese-PCR

amplifizierten Plasmid-DNA. Es wurde sichtbar, ob die PCR ausreichend Produkt erbracht

hatte. Anhand eines Markers konnte die molekulare Masse des Produkts a/jointfilesconvert/377385/bgeschätzt und

kontrolliert werden.

Zur Herstellung der Gele wurde 1g Agarose in 100 ml TAE-Puffer in der Mikrowelle unter

Kochen gelöst. Nach dem Abkühlen auf ca. 60°C wurde auf 50 ml Agarose 3 µl

Ethidiumbromid-Stammlösung gegeben und die Flüssigkeit in eine Gelkammer gegossen.

Je 10 µl Plasmid-DNA-Probe wurden mit DNA-Stopp-Puffer versetzt und nach dem Erhärten

der Gele in die Geltaschen gefüllt. Die Elektrophorese wurde bei einer konstanten Spannung

von 100 V ca. 45 min lang durchgeführt.

Ausgewertet wurde das Agarosegel unter einem UV-Leuchtschirm.

DNA-Marker

λ-DNA-Marker (HindIII-geschnitten)

23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564, 125 Basenpaare

λ-DNA-Marker (BstEII geschnitten)

8454, 7242, 6369, 5686, 4822, 4324, 3675, 2323, 1929, 1371, 1264, 702 Basenpaare

3.8 Herstellung kompetenter Bakterienzellen

Bakterien, die die Fähigkeit besitzen, in Lösung befindliche DNA aufzunehmen, werden in

der Mikrobiologie als „kompetent“ bezeichnet. Sie können diese Fähigkeit von Natur aus

haben oder sie nach Behandlung mit geeigneten Methoden erlangen. Den Vorgang der

Übertragung gereinigter, gelöster DNA auf Bakterien nennt man in der Gentechnik

„Transformation“.

1 2 ... 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 ... 93 94

Sem comentários

E3Switch DE3 Manual do Utilizador Página 51